איתור גנים מפטריות לשיפור הפקת דלק ביולוגי

אוקטובר 2015, גליון 3, (עמ' 217-222)



-
הדפס PDF שלח לחבר



דריה פלדמן, עודד ירדן ויצחק הדרהמחלקה למחלות צמחים ומיקרוביולוגיה, הפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית, האוניברסיטה העברית בירושלים, daria.feldman@mail.huji.ac.il

לפטרית המאכל Pleurotus ostreatus יכולות מיוחדות של פירוק ליגנין ותרכובות כימיות מגוונות, כולל תרכובות רעילות לשמרים. תכונות אלו עשויות לתרום לשיפור תהליך הפקה של דלק ביולוגי מדור שני מביומסה צמחית | צילום: Charl de Mille-Isles

 

 רקע

דלקים ביולוגיים מיוצרים ממקורות אנרגיה מתחדשים, ויכולים להפחית את השימוש בדלקי מחצבים, את השחרור של פחמן דו-חמצני לאטמוספרה ואת ההתחממות העולמית. הקטנת כמות הפחמן הדו-חמצני המשתחרר נובעת מצריכתו במהלך גדילת הצמחים הדרושים לביומסה שהדלק הביולוגי מיוצר ממנה [12]. הדור הראשון של הדלק הביולוגי מיוצר מתוצרת חקלאית, בעיקר תירס, שהופכת לאתנול בתהליך של תסיסה על-ידי שמרים. דלק ביולוגי מסוג זה נמצא בשימוש בעיקר בארה"ב ובברזיל (מעל 85% מהכמות הנצרכת ברחבי העולם). שימושו העיקרי כיום הוא כדלק לתחבורה, ויותר מ-20 מיליון כלי רכב, שהם כ-10% מכמות כלי הרכב העולמית, צורכים ערבוב בין דלק רגיל לדלק ביולוגי [3]. אולם הדור הראשון של דלק ביולוגי לא חף מחסרונות, וייצור האתנול מתוצרת חקלאית העלה את מחירי המזון בעולם [12].

דלק ביולוגי מדור שני מבוסס גם כן על ביומסה צמחית שהאתנול מיוצר ממנה בתהליך של תסיסה, והוא תחליף אפשרי לדלק לתחבורה [2]. בניגוד לדור הראשון, מקור הביומסה הוא פסולת חקלאית, צמחים לא-חקלאיים או צמחים שמהונדסים גנטית לשימוש זה. מקורות אלה לביומסה מצויים בשפע, אינם מתחרים עם חומרי גלם לתעשיית המזון, ומהווים מקור אנרגיה מתחדש. בדומה לדור הראשון, דלק ביולוגי מהדור השני יכול להקטין את התלות שלנו בדלק שמקורו בנפט, וכך להקטין את פליטת הפחמן.

המרכיב העיקרי של הביומסה המשמשת לתעשיית הדלק ביולוגי הוא דופן התא הצמחי הבנוי מליגנו-צלולוז. הליגנו-צלולוז מורכב מהרב-סוכרים תאית והמיצלולוז, ומהפולימר הארומטי ליגנין, המקנה הגנה פיזיקלית וכימית לדופן מפני פירוק [7]. בניגוד לעמילן, שהוא המקור העיקרי לייצור אתנול בדור הראשון, הסוכרים המורכבים בביומסה קשורים לליגנין, ולכן נחוץ תהליך נוסף במהלך ייצור הדלק ביולוגי מהדור השני, שיאפשר פירוק אנזימטי של הסוכרים לצורך התסיסה. תהליך זה נקרא טיפול מקדים (pretreatment), ונעשה בשיטות שונות המבוססות בעיקר על פירוק הקשרים הללו בעזרת חום או אמצעים כימיים. יתרונות של שלב הוספת הטיפול המקדים הם שבירת התאית, ההמיצלולוז ומארג הליגנין, כדי לשחרר חד-סוכרים ולאפשר גישת אנזימים לסוכרים המורכבים. שלב זה צריך לעמוד במספר דרישות:

  1. שיפור יעילות הייצור של סוכרים לא-מורכבים בהידרוליזה;
  2. הימנעות מפירוק ומאיבוד של תאית והמיצלולוז;
  3. הימנעות מיצירה של תוצרי לוואי שיעכבו את תהליך התסיסה;
  4. עלות נמוכה יחסית.

 ניתן לחלק את השיטות שהטיפול המקדים נעשה בהן לקבוצות: פיזיקליות (טחינה ושחיקה), כימיות-פיזיקליות (שימוש בקיטור ובחום), כימיות (בסיסים, חומצות, חומרים מחמצנים וממסים אורגניים), ביולוגיות, חשמליות או שילוב של מספר שיטות בזו אחר זו. אף על פי ששלב הטיפול המקדים נועד לשפר את תהליך ייצור הדלק ביולוגי, נוצרות במהלכו תרכובות שרעילות לשמרים, כגון תרכובות פוּרָניות (furans) ופֶנוֹליות (phenolic compounds). התרכובות מעכבות את תהליך התסיסה, שהוא מרכיב מרכזי בתהליך הייצור [8, 13]. כתוצאה מכך, הטיפול המקדים הוא אחד מ"צווארי הבקבוק" העיקריים ליעילות תהליך הייצור של הדלק הביולוגי [14]. תרכובות פורניות, בעיקר furfural ו-HMF (5-hydroxymethylfurfural ), נחשבות תרכובות רעילות במיוחד. קצב גידול השמרים מושפע יותר מ-furfural, אבל תוצאה מחשיפה ל-HMF נמשכת זמן רב יותר [15]. שתי התרכובות הפורניות משפיעות באופן ישיר לא רק על קצב גידול השמרים, אלא גם מעכבות באופן ספציפי אנזימים הדרושים לתהליך התסיסה [15]. התהליך המטבולי לפירוק של HMF בשמרים ידוע, ובמהלכו עוברת המולקולה תהליך של חיזור ל-HMF alcohol (2,5-bis-hydroxymethylfuran) [10, 11]. כמו כן, זוהו חיידקים שיכולים לפרק HMF בתהליך של חמצון ל- HMF acid (5-(hydroxymethyl) furoic acid) ולאחריו ל-FDCA (2,5-furandicarboxylic acid), שבמהלכו נוצרים מי חמצן [4].

במחקר זה התמקדנו בפטרייה אזניית הצדף (Pleurotus ostreatus) המשתייכת לקבוצת פטריות הריקבון הלבן. האזנייה היא פטריית המאכל השלישית מבחינת היקף גידולה בעולם [6], ובהקשר המדעי היא מכונה פלארוֹטוּס. העניין הביוטכנולוגי בפטרייה זו גבר הודות ליכולתה לפרק ליגנין ותרכובות כימיות מגוונות, כולל תרכובות רעילות לשמרים [1, 9]. מכל הסיבות הללו אנו משערים שפלארוטוס יכולה להתמודד עם תרכובות רעילות משלב הטיפול המקדים, כמו HMF, בצורה טובה או שונה משמרים. במחקר זה התמקדנו במספר מטרות: לבדוק אם פלארוטוס יכולה לפרק HMF בצורה יעילה, לבחון אם ההשפעה השלילית על שמרים מופחתת כתוצאה מפירוק זה, ולהבין מהו מערך הגנים והאנזימים המעורבים בתהליך. בעקבות מחקר זה ניתן יהיה לשלב את הפטרייה כחלק מהטיפול המקדים או לבטא חלק מהגנים בשיטות של הנדסה גנטית בשמרים וכך לשפר את עמידותם לכימיקל.

 

חומרים ושיטות

במחקר זה נעשה שימוש בזן PC9 של הפטרייה פלארוטוס שהוא monokaryon (קור פטרייה בעל סוג אחד של גרעינים) של זן N001. גידול הפטרייה נעשה על מצע מוצק או נוזלי על בסיס גלוקוז-פפטון ב-28 מעלות צלזיוס. לצורך בחינת קצב פירוק ה-HMF,וביטוי החלבונים והגנים, גודלה הפטרייה ללא טלטול במשך 5 ימים, שלאחריהם הוסף למצע HMF בריכוז שלmM  30. ריכוז ה-HMF במצע נקבע על-ידי שימוש בספקטרופוטומר וזיהוי תוצרי הפירוק בכרומוטוגרף גזים המצומד לספקטרומטר מסות [5].

פרופיל הביטוי של חלבונים תוך-תאיים ושל אלה המופרשים למצע, נקבע לאחר הפרדת החלבונים על-ידי אקלטרופורזה בג'ל (מפל של 4-12%). זיהוי החלבונים נעשה באמצעות כרומטוגרף נוזלים בלחץ גבוה המצומד לספקטרומטר מסות ואחריו לספקטרומטר מסות נוסף (HPLC/MS/MS) (היחידה לפרוטאומיקה, הטכניון).

ביטוי הגנים נקבע לאחר הפקת ה-RNA מתפטיר הפטרייה בזמנים שונים, סינתזה של cDNA ומעקב אחר רמות ביטוי בשיטה של Real-Time PCR (ABI StepOne). לצורך החישוב, ביטוי הגנים נקבע ביחס לביטוי של בטא-טובולין, וחושב ביחס לביטוי הגנים ללא הוספת HMF למצע הגידול.

יצירת מי חמצן כתוצרה מפעילות אריל אלכוהול אוקיסדז נמדדה בדוגמאות שנלקחו ממצע הגידול באמצעות ערכה מסחרית Amplex Red™ (Invitrogen). פעילות תוך-תאית של אריל אלכוהול דה-הידרוגנז נמדדה לאחר הפקת חלבונים מתפטיר הפטרייה, ומעקב בספקטרופוטומר (באורך גל (340 nm אחר פירוק של הגורמים המשלימים NADH או NADPH לאורך זמן, כאשר HMF שימש מצע.

 

תוצאות

פלארוטוס מפרקת HMF

נערכו ניסויים לשם בחינת השפעת הHMF על הפטרייה, כלומר כדי להעריך את סבילותה לחומר ובעקבות זאת להעריך את יכולתה לפרקו ולנטרל את רעילות. עקבנו אחר קצב הגדילה של הפטרייה על גבי מצע מוצק, כאשר למצע הוספו ריכוזים שונים של HMF. עיכוב של 50% בקצב הגידול נצפה בריכוז של 12.5 mM, ריכוז הגורם לתמותת שמרים. כדי לבדוק אם היכולת לגדול על ריכוזים גבוהים שלHMF  נובעת מיכולתה של הפטרייה לפרק את החומר, עברנו לעבוד במערכת עם מצע נוזלי, ועקבנו אחרי היעלמות ה-HMF לאורך זמן. לצורך הניסוי גידלנו את הפטרייה במצע נוזלי לאורך חמישה ימים, שלאחריהם הוספנו HMF בריכוז של 30 nM, ועקבנו אחר פירוקו. לאחר 8 שעות מרגע הוספת החומר הייתה ירידה של כ-10% בכמותו, לאחר 24 שעות נצפה פירוק של 50%, ולאחר 48 שעות לא נמצא יותר HMF במצע הגידול. במקביל לפירוק HMF ראינו עלייה בתוצרי פירוק ידועים שלו, HMF alcohol שזוהה במצע כבר לאחר 8 שעות, ושכמותו עלתה בהדרגה עד 48 שעות לאחר הוספת ה-HMF, ו-FDCA שזוהה לאחר 24 שעות מרגע ההוספה, אבל לא בזמנים מאוחרים יותר.

בחנו אם פירוק HMF על-ידי פלארוטוס עוזר להפחית את ההשפעה הרעילה של HMF על שמרים. במהלך הניסוי גידלנו פלארוטוס במצע נוזלי, ונלקחו דגימות של המצע לאחר 8, 24 ו-48 שעות מהוספת HMF. הדגימות הללו שימשו מצע לשמרים לצורך מעקב אחרי קצב גדילתם לאורך זמן, תוך מעקב אחר עכירות המצע. כבר לאחר 8 שעות שפורק בהן רק חלק מה-HMF, היה שיפור של 50% ביכולת הגידול של השמרים לעומת ביקורת ללא טיפול מוקדם על-ידי פלארוטוס. לאחר 24 שעות נמצא שיפור של 85%, ולאחר 48 שעות גידול השמרים היה זהה לביקורת ללא HMF (איור 1). תוצאות אלה מראות שפלארוטוס יכולה לפרק HMF לתוצרים שאינם רעילים לשמרים.

  

הבנת המנגנון הגנטי והביוכימי לפירוק HMF על-ידי פלארוטוס

כדי להבין את המנגנון הביוכימי של פירוק HMF על-ידי פלארוטוס, הפקנו חלבונים מופרשים ותוך-תאיים של הפטרייה לאחר חשיפה ל-HMF. בחנו את פרופיל החלבונים שמתקבל לאחר הפרדה לפי משקל מולקולרי בג'ל. מבחינת חלבונים שהופרשו לתוך המצע, ראינו עלייה בחלבונים בעלי משקל מולקולרי של  kDa75 לאחר חשיפה ל-HMF, והכמות המרבית נצפתה לאחר 24 שעות מרגע החשיפה. בו-בזמן נצפתה בחלבונים התוך-תאיים של הפטרייה עלייה דומה בחלבונים בעלי משקל מולקולרי של kDa 45. בוצע זיהוי של החלבונים באמצעות ספקטרומטר מסות, והתגלה שהחלבונים המופרשים, שכמותם עלתה, שייכים למשפחת האנזימים של אריל אלכוהול אוקסידז (aryl alcohol oxidase) והחלבונים התוך-תאיים למשפחה של אריל אלכוהול דה-הידרוגנז (aryl alcohol dehydrogenase). שתי המשפחות הללו שייכות למערך האנזימים שאחראים לפירוק ליגנין, ויכולות לחמצן ולחזר, בהתאמה, מגוון רחב של מולקולות.

בחנו אם הוספת HMF גורמת להצטברות האנזימים הללו או משרה את היווצרותם, כדי להבין אם פירוק חומר זה על-ידי פלארוטאוס נעשה על-ידי מארג אנזימים קיים או שהוא מופעל על-ידי בקרה ברמה הגנטית. לשם כך עקבנו אחרי ביטוי הגנים המקודדים לחלבונים שזוהו. רמת השעתוק של הגנים עלתה בצורה משמעותית עם החשיפה ל-HMF, והביטוי עלה פי 30300 כבר לאחר חצי שעה מרגע הוספת ה-HMF. כלומר,HMF  משרה את ייצור האנזימים דרך בקרה ברמת השעתוק.

בחנו אם HMF גרם להשראת האנזימים אריל אלכוהול אוקסידז ודה-הידרוגנז כחלק מהתגובה הכללית של פלארוטוס לכימיקל, או שהאנזימים הללו יכולים גם לפרקו. האנזימים מסוג אריל אלכוהול אוקסידז מייצרים מי חמצן כחלק מהפעילות הספציפית שלהם. היות שכך, בחנו במבחנה (in vitro) את הפעילות של ייצור מי החמצן בחלבונים שמפרישה הפטרייה עם חשיפה ל-HMF ובלעדיה, כאשר המצע היה HMF. בביקורת ללא חשיפה ל-HMF לא נמדדו מי חמצן בתגובה, וכבר לאחר 8 שעות מרגע הוספת ה-HMF נמדדה פעילות ספציפית. פעילות תוך-תאית של פירוק HMF נמדדת ביכולת לנצל את הגורמים המשותפים NADH או NADPH, הדרושים לאנזימים לשם חיזורו. בחנו את הפעילות של החלבונים התוך-תאיים, שאריל אלכוהול דה-הידרוגנז משתייך אליהם, במבחנה, תוך מעקב אחרי היעלמות הגורמים המשותפים. בחלבונים שהופקו מפטרייה שנחשפה לפני כן ל-HMF הייתה עלייה משמעותית בפעילות הספציפית עם הגורם המשותף NADPH, אך לא עם NADH.NADPH  דרוש כגורם משותף לפעילות אריל אלכוהול דה-הידרוגנז. כלומר, HMF משרה את ביטוי האנזימים אריל אלכוהול אוקסידז ודה-הידרוגנז שאחראים לפירוקו (איור 2).

דיון ומסקנות

במחקר זה תיארנו את היכולת של הפטרייה פלארוטוס לפרק HMF, תוצר רעיל של שלב הטיפול המקדים ביצירת דלק ביולוגי מהדור השני. להפתעתנו, הפירוק נעשה בעזרת אנזימים ששייכים למערכת פירוק הליגנין בפטרייה, שמעניינים גם להיבטים נוספים של ייצור דלק ביולוגי. לאור תוצאות המחקר אנו מציעים לשלֵב פלארוטוס כחלק משְלָב הטיפול המקדים הנעשה כיום בצורה כימית ופיזיקלית. ניתן לבטא בשמרים, בשיטות של הנדסה גנטית, את הגנים המקודדים לאריל אלכוהול אוקסידז ודה-הדירוגנז מפלארוטוס, שאינם קיימים בשמרים. בצורה זו נוכל לשפר משמעותית את יכולת הפירוק של HMF על-ידי השמרים, ולהתמודד בצורה חלקית עם האתגר שבשלב הטיפול המקדים. הדבר יביא לשיפור יעילות ייצור הדלק הביולוגי מהדור השני, ויקדם את השימוש המסחרי בו. 

 

מקורות

[1] Bezalel L, Hadar Y, and Cerniglia CE. 1997. Enzymatic mechanisms involved in phenanthrene degradation by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Environmental Microbiology 63: 2495-2501.

[2] Carroll A and Somerville C. 2009. Cellulosic Biofuels. Annual Review of Plant Biology 60: 165-182.

[3] Committee RS. 2014. Renewables 2014 global status report. In: Sawin J (Ed). Renewable energy policy network for the 21st Century. REN2, Paris, France.

[4] Dijkman WP and Fraaije MW. 2014. Discovery and Characterization of a 5-Hydroxymethylfurfural Oxidase from Methylovorus sp Strain MP688. Applied and Environmental Microbiology 80: 1082-1090.

[5] Feldman D, Kowbel DJ, Glass NL, et al. 2015. Detoxification of 5-hydroxymethylfurfural by the Pleurotus ostreatus lignolytic enzymes aryl alcohol oxidase and dehydrogenase. Biotechnology for Biofuels 63: 1-11.

[6] Hadar Y, Kerem Z, Gorodecki B, and Ardon O. 1992. Utilization of lignocellulosic waste by the edible mushroom, Pleurotus. Biodegradation 3: 189-205.

[7] Kirk TK and Farrell RL. 1987. Enzymatic combustion – The microbial degradation of lignin. Annual Review of Microbiology 41: 465-505.

[8] Klinke HB, Thomsen AB, and Ahring BK. 2004. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Applied Microbiology and Biotechnology 66: 10-26.

[9] Larraya LM, Perez G, Penas MM, et al. 1999. Molecular karyotype of the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Environmental Microbiology 65: 3413-3417.

[10] Liu ZL, Slininger PJ, Dien BS, et al. 2004. Adaptive response of yeasts to furfural and 5-hydroxymethylfurfural and new chemical evidence for HMF conversion to 2,5-bis-hydroxymethlfuran. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 31: 345-352.

[11] Liu ZL. 2006. Genomic adaptation of ethanologenic yeast to biomass conversion inhibitors. Applied Microbiology and Biotechnology 73: 27-36.

[12] Naik SN, Goud VV, Rout PK, and Dalai AK. 2010. Production of first and second generation biofuels: A comprehensive review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 14: 578-597.

[13] Palmqvist E and Hahn-Hagerdal B. 2000. Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: Inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology 74: 25-33.

[14] Parawira W and Tekere M. 2011. Biotechnological strategies to overcome inhibitors in lignocellulose hydrolysates for ethanol production: Review. Critical Reviews in Biotechnology 31: 20-31.

[15] Taherzadeh MJ, Gustafsson L, Niklasson C, and Liden G. 2000. Physiological effects of 5-hydroxymethylfurfural on Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology 53: 701-708.






רשות הטבע והגנים החברה להגנת הטבע Israel Nature and Parks Authority Society for the Protection of Nature in Israel